摘要：骨髓8間充質(zhì)干細(xì)胞是存在于骨髓中的除造血干細(xì)胞以外的另外的另一類具有多向分化潛能的干細(xì)胞。在一定的誘導(dǎo)條件下，這類細(xì)胞可定向分化為造血系統(tǒng)以外多種組織細(xì)胞，特別是中胚層和神經(jīng)外胚層來源的組織細(xì)胞。例如成骨細(xì)胞、成軟骨細(xì)胞、脂肪細(xì)胞、腱細(xì)胞、肌肉細(xì)胞、神經(jīng)細(xì)胞等。骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞具有貼壁生長的特性，能在體外易分離和擴(kuò)增，還可用于外源基因的轉(zhuǎn)入和表達(dá)，在人類醫(yī)學(xué)上被認(rèn)為是一種理想的治療性細(xì)胞和基因治療中的靶細(xì)胞。本文針對骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的研究進(jìn)展和在臨床醫(yī)學(xué)上的應(yīng)用進(jìn)行綜述。
　　關(guān)鍵詞：骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞；綜述；定向引導(dǎo)；
　　組織工程骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞（bonemarrowmesenchymalstemcells,BMSCS）也稱骨髓基質(zhì)來源干細(xì)胞，因呈成纖維樣外觀，所以也稱為集落形成單位成纖維細(xì)胞（colony—formingunitesfibroblasts,CFUF）,至今還沒有相對統(tǒng)一的命名。但大量的研究表明：BMSC是可以分化為成骨細(xì)胞、成軟骨細(xì)胞、脂肪細(xì)胞、肌細(xì)胞、神經(jīng)細(xì)胞、腱細(xì)胞等的一種具有多項(xiàng)分化潛的能干細(xì)胞。在體外易分離和擴(kuò)增，且便于細(xì)胞移植。此外，BMSC獨(dú)特的增殖分裂模式使外源基因易于導(dǎo)入和表達(dá)。因此，BMSC在組織工程、細(xì)胞治療和基因治療中具有廣闊的應(yīng)用前景。
　　骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的研究歷史
　　130年前，德國病理學(xué)家Cohnhein在研究傷口愈合過程中首次提出骨髓中存在充質(zhì)干細(xì)胞(MSC)的觀點(diǎn)。他是在試驗(yàn)中給動物靜脈注射一種不溶性染料analine，然后在肢體遠(yuǎn)端人為造成損傷。結(jié)果在傷口愈合部位有含染料的細(xì)胞，包括炎癥細(xì)胞與成纖維樣細(xì)胞。后來由于受到條件的限制，這些研究未能繼續(xù)進(jìn)行。直到1976年，F(xiàn)riedenstein等，從骨髓中分離得到長梭狀、成纖維細(xì)胞樣、以貼壁生長并可形成集落的細(xì)胞群，即成纖維集落形成單位。1987年，F(xiàn)riedenstein等又發(fā)現(xiàn)在塑料培養(yǎng)皿中培養(yǎng)的貼壁骨髓單核細(xì)胞在特定的條件下可分化為成骨細(xì)胞、成軟骨細(xì)胞、脂肪細(xì)胞和成肌細(xì)胞，并且擴(kuò)增20－30代后仍保持其多向分化潛能。
　　骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的分離與培養(yǎng)
　　目前，BMSC的分離純化及體外培養(yǎng)方法，由于各實(shí)驗(yàn)室的條件不同，許多實(shí)驗(yàn)室仍是在Friedenstein等方法基礎(chǔ)上進(jìn)行一定的改進(jìn)，即根據(jù)BMSC易于黏附塑料底物的特性來實(shí)現(xiàn)分離。每次更換培養(yǎng)基時(shí)，先吸去培養(yǎng)液，再用Tyrode’S平衡鹽溶液沖洗2-3遍，沖去懸浮生長的造血干細(xì)胞，再加入新鮮培養(yǎng)基，稱為貼壁篩選法；根據(jù)BMSC與其它細(xì)胞密度不同，采用細(xì)胞分離液來分離。把分離的骨髓緩慢轉(zhuǎn)入細(xì)胞分離液表面，進(jìn)行離心，再收獲分離單核細(xì)胞進(jìn)行培養(yǎng)，即密度梯度離心法；根據(jù)細(xì)胞大小或者細(xì)胞表面的一些特殊標(biāo)志來進(jìn)行分離，即流式細(xì)胞儀分選法。這一方法已商業(yè)化，分選純度可達(dá)98%以上。用貼壁篩選法分離得到的是一個(gè)異質(zhì)細(xì)胞群，含有多種其它成分。因?yàn)锽MSC是一類比較脆弱的祖細(xì)胞，當(dāng)經(jīng)過流式細(xì)胞儀時(shí)可導(dǎo)致某些活性完全丟失，而用密度梯度離心法可得到形態(tài)和性質(zhì)均一的BMSC。因此，目前廣泛采用的是利用密度梯度離心法來分離純化BMSC。國外較為關(guān)注的另一種方法是依據(jù)BMSC對生長因子的反應(yīng)性不同，通過選擇適當(dāng)?shù)囊蜃哟碳ぴ鲋扯�獲得含有較高比例BMSC。此外，在國外還建立了一種簡單經(jīng)濟(jì)高效的分離BMSC的方法，即利用一種具有3mm孔徑的塑料培養(yǎng)皿從骨髓中篩選MSC，這種方法篩選出來的BMSC均質(zhì)性大于98％，并具有自我增殖和更新及分化為各種結(jié)締組織的能力。
　　常用的細(xì)胞培養(yǎng)液有DMEM-F12、RPMI1640等。同時(shí)在培養(yǎng)基中還要加入一定比例的動物血清，一方面血清富含細(xì)胞生長、繁殖所需要的營養(yǎng)成分，另一方面含促進(jìn)細(xì)胞貼壁的因子，使細(xì)胞能更好地貼壁生長，并且還能緩沖pH和抑制蛋白酶的作用。1995年Lennon等建立了一種無血清培養(yǎng)體系。由于要加入一些價(jià)格昂貴的因子，因此，這種培養(yǎng)方法未能得到推廣。隨著對BMSC研究的不斷深入，今后用無血清培養(yǎng)基體外培養(yǎng)BMSC也是一種必然的趨勢。
　　骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的生物學(xué)特性
　　體外培養(yǎng)的BMSC體積小，結(jié)構(gòu)簡單，成梭形，核質(zhì)比較大，能以自我繁殖的方式增殖，不表達(dá)分化相關(guān)的細(xì)胞標(biāo)志，也不表達(dá)造血干細(xì)胞的表面標(biāo)志。
　　BMSC最重要的特性是具有多項(xiàng)分化潛能，針對不同的分化方向采用不同的誘導(dǎo)劑，通過體外貼壁培養(yǎng)，可分化為多種造血以外的組織細(xì)胞，特別是來源于中胚層和神經(jīng)外胚層的組織細(xì)胞。近20年來發(fā)現(xiàn)了多種BMSC體外誘導(dǎo)條件。采用地塞米松，磷酸甘油和抗壞血酸等單獨(dú)或聯(lián)合誘導(dǎo)，可以分化成為骨細(xì)胞，形成聚集體或結(jié)節(jié)，堿性磷酸酶活性增高；在高糖DMEM培養(yǎng)基中加入地塞米松、胰島素、TGF-1等可誘導(dǎo)BMSC向成軟骨細(xì)胞分化；另外，用a.巰基乙醇（BME）、二甲基亞砜（DMSO）和丁羥基茴香醚（BHA）等一些具有還原性的物質(zhì)成功誘導(dǎo)了MSC轉(zhuǎn)變?yōu)樯窠?jīng)元，并表達(dá)神經(jīng)元特有的標(biāo)記，例如：神經(jīng)微絲（NF.M）、神經(jīng)元核心抗原（NeuN）、tau蛋白以及神經(jīng)特異烯醇化酶（NSE）等；在培養(yǎng)液中加入1－甲基.3－異丁基黃嘌呤、地塞米松、胰島素、消炎痛時(shí)，則細(xì)胞內(nèi)含脂豐富的小泡逐漸增多，即形成脂肪細(xì)胞。目前，仍未篩選到BMSC上特有的標(biāo)記分子，尚無直接方法可進(jìn)行鑒定。各實(shí)驗(yàn)室鑒定BMSC的方法都是通過在培養(yǎng)過程中出現(xiàn)分化表型，然后逆推得知是否為MSC.對細(xì)胞表面蛋白如SH-2,SH-3,SH-4,SB-10,
　　CD29，CD84,CD71,CD90,CD106,CD120a和CD124等成陽性反應(yīng)，而
　　CDla,CD31,CD34,CD14,CIM5,CD56和ESA則為陰性。在篩選時(shí)陰性反應(yīng)也可以作為一定的參考。據(jù)報(bào)道，BMSC的表面抗原并不特別，它具體有間質(zhì)細(xì)胞、上皮細(xì)胞和內(nèi)皮細(xì)胞表面抗原的特征，即它可表達(dá)多種黏附相關(guān)分子。例如：整合素亞基a4、a5、1以及整合素3、5，ICAM.1，CD44等。BMSC除了可分化形成多種基質(zhì)細(xì)胞外，它本身還可分泌多種造血生長因子來支持造血。例如白介素、趨化因子等。
　　骨MSC在臨床上的應(yīng)用及前景
　　BMSC在體外易于分離培養(yǎng)，并能保持其多向分化潛能，遺傳背景穩(wěn)定，植入體內(nèi)無免疫排斥反應(yīng)，即使是同種異體移植，由于BMSC屬于未分化的前體干細(xì)胞，其細(xì)胞表型的分化尚不成熟，BMSC移植后有排斥也十分微弱。BMSC可被作為細(xì)胞工程中較理想的種子細(xì)胞，并很有可能作為自體細(xì)胞構(gòu)建的組織工程化骨組織應(yīng)用于臨床。目前，對BMSC在骨與軟骨損傷方面的研究較深，美國bruder采用擴(kuò)增后的人BMSC作為移植物進(jìn)行骨再生研究，結(jié)果發(fā)現(xiàn)BMSC產(chǎn)生新的骨組織，可用于重建臨床上明顯的骨缺失，為自體骨移植開辟了新渠道。在體外將覆蓋有BMSC的陶瓷支架植入狗股骨缺損處，結(jié)果發(fā)現(xiàn)比單純植入陶瓷支架促進(jìn)骨折愈合的效果要好。同樣，將覆蓋有已分化為軟骨細(xì)胞的碳纖維網(wǎng)植入兔受損關(guān)節(jié)部位，結(jié)果也顯示出比單純植入碳纖維網(wǎng)更明顯的促進(jìn)關(guān)節(jié)軟骨修復(fù)的作用。在Ⅰ期臨床上，BMSC已作為在大劑量化療后骨髓移植的輔助治療。Koc等將自體造血干細(xì)胞與培養(yǎng)擴(kuò)增后的BMSC共輸入高劑量化療后的晚期乳腺癌患者，可使造血功能恢復(fù)加快。將人BMSC注入大鼠紋狀體內(nèi)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)BMSC向鄰近腦組織遷移，并逐漸丟失BMSC上的標(biāo)志蛋白，例如：骨膠原蛋白、纖維連接蛋白，并且表現(xiàn)出與神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞一樣的特征（GFAP）；將雄性大鼠的骨髓植入放射線致死量照射的同系雌性大鼠體內(nèi)，通過Y染色體探針原位雜交和不同基因表型的檢測發(fā)現(xiàn)，該大鼠肝臟有供體骨髓來源的肝臟卵原細(xì)胞，且能夠分化為成熟的肝臟細(xì)胞。利用培養(yǎng)自體的BMSC懸浮在膠原凝膠的載體上，在兔的跟腱作1cm長的斷口損傷，把細(xì)胞－凝膠復(fù)合物種植在肌腱的接縫上，同時(shí)在對側(cè)肌腱作較小的切口，結(jié)果發(fā)現(xiàn)裝載BMSC的種植物能夠使損傷的肌腱在生化特性、結(jié)構(gòu)和功能上得到修復(fù)。近來，BMSC在分子細(xì)胞生物學(xué)方面的應(yīng)用吸引了越來越多的科研工作者的關(guān)注。BMSC由于獨(dú)特的生物學(xué)特性使得外源基因易表達(dá)。在體外將BMSC的基因修飾后用于臨床治療，可以避免傳染載體內(nèi)產(chǎn)生的副作用。大量的實(shí)驗(yàn)證明，貼壁生長的BMSC經(jīng)過介導(dǎo)容易導(dǎo)入外源性基因，并能在體能長期高效的表達(dá)，研究證實(shí)，使用包含猿白血病病毒外殼的逆轉(zhuǎn)錄病毒載體將VⅢ因子基因轉(zhuǎn)入人或鼠的BMSC具有很高的傳染率。目前在人和動物的BMSC中已成功轉(zhuǎn)入了幾種不同外源基因，且未能引起細(xì)胞性能的缺陷。同時(shí)也可以在體外跟蹤含遺傳標(biāo)記的BMSC，將正常基因?qū)�入人發(fā)生異常突變的動物體內(nèi)。例如有人將標(biāo)記rhBMP的基因?qū)�入動物體內(nèi)的BMSC內(nèi)，將BMSC移植回動物大腿骨的骨損傷部位，在第8周觀察到了骨恢復(fù)。有實(shí)驗(yàn)證明基因修飾后BMSC能夠存活于大腦，并激活和表達(dá)基因產(chǎn)物。例如將膠質(zhì)細(xì)胞來源的神經(jīng)營養(yǎng)因子（GDNF）的基因轉(zhuǎn)入到雄性鼠的BMSC中，然后把這些細(xì)胞靜脈注入到健康雄性鼠體內(nèi)，8周后建立帕金森氏癥的模型，觀察轉(zhuǎn)入GDNF基因后的BMSC對黑質(zhì)細(xì)胞的保護(hù)作用，結(jié)果發(fā)現(xiàn)酪氨酸酶(TH)呈陽性，黑質(zhì)神經(jīng)元明顯高于對照組；Schwarz等用基因工程技術(shù)將TH和GTP水解酶Ⅰ的基因轉(zhuǎn)入BMSC中，再將其輸入到帕金森氏癥的兔模型中，結(jié)果發(fā)現(xiàn)被轉(zhuǎn)入的基因能夠在體內(nèi)持續(xù)表達(dá)9d；在血友病治療方面，baroffio等將人的FIXcDNA經(jīng)逆轉(zhuǎn)錄病毒介導(dǎo)轉(zhuǎn)入BMSC中，然后靜脈注入狗體內(nèi)，第2d檢測到人FIX水平達(dá)0.233ug/ml,可大大減輕B型血友病病人的癥狀。除此之外，經(jīng)過體外大量擴(kuò)增基因操作的BMSC還可治療許多其他疾病。

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