【摘要】目的：建立陳香露白露片藥物微生物限度檢查方法。方法：根據(jù)該樣品的微生物限度標(biāo)準(zhǔn)，按《中國(guó)藥典》2005年版一部附錄微生物限度檢查法的驗(yàn)證試驗(yàn)指導(dǎo)原則，用委托廠家3個(gè)批號(hào)的陳香露白露片藥物進(jìn)行驗(yàn)證試驗(yàn)，以考察確定陳香露白露片藥物微生物限度的檢查方法。首先用常規(guī)法進(jìn)行預(yù)試驗(yàn)，初步考察該樣品對(duì)試驗(yàn)菌檢測(cè)的影響，然后根據(jù)預(yù)試驗(yàn)結(jié)果，用離心沉淀集菌法進(jìn)行再試驗(yàn)。結(jié)果：常規(guī)法試驗(yàn)時(shí)，大腸埃希菌、白色念珠菌的回收率均大于70%，而金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌的回收率小于70%，控制菌檢查檢出試驗(yàn)菌。采用離心沉淀集菌法試驗(yàn)時(shí)，可以有效消除抑菌作用，使金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌的回收率大于70%。結(jié)論：采用離心沉淀集菌法可以有效消除抑菌作用，簡(jiǎn)便、準(zhǔn)確。
　　【關(guān)鍵詞】微生物限度檢查論文，驗(yàn)證試驗(yàn)論文，離心沉淀集菌法論文
　　陳香露白露片藥物是一復(fù)方中成藥制劑，由川木香、大黃、石菖蒲、陳皮、甘草、次硝酸鉍、氧化鎂、碳酸氫鈉組成，用于胃潰瘍、糜爛性胃炎、胃酸過(guò)多等疾病［1］。《中國(guó)藥典》2005年版規(guī)定，在進(jìn)行藥品微生物限度檢查時(shí)，應(yīng)對(duì)所用方法進(jìn)行驗(yàn)證，以確認(rèn)所采用的方法適合于該藥品的微生物限度檢查。為此，筆者對(duì)陳香露白露片藥物的微生物限度檢查方法進(jìn)行了驗(yàn)證試驗(yàn)。
　　1試驗(yàn)材料論文
　　1.1樣品
　　
　　陳香露白露片藥物（云南龍發(fā)制藥有限公司；規(guī)格：100片/瓶；批號(hào)：060401、060402、060403）。
　　1.2稀釋劑及培養(yǎng)基
　　
　　pH7.0無(wú)菌氯化鈉�驳鞍纂司彌_液、0.9%無(wú)菌氯化鈉溶液、TTC營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基、玫瑰紅鈉瓊脂培養(yǎng)基、膽鹽乳糖培養(yǎng)基、MUG培養(yǎng)基、膽鹽乳糖發(fā)酵培養(yǎng)基、營(yíng)養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基、改良馬丁培養(yǎng)基。
　　1.3菌種
　　
　　金黃色葡萄球菌［CMCC（B）26003］、大腸埃希菌［CMCC（B）44102］、枯草芽孢桿菌［CMCC（B）63501］、白色念珠菌［CMCC（F）98001］，均來(lái)源于云南省食品藥品檢驗(yàn)所。
　　2驗(yàn)證試驗(yàn)論文
　　2.1試驗(yàn)菌液的制備
　　
　　接種金黃色葡萄球菌、大腸埃希菌、枯草芽孢桿菌的新鮮培養(yǎng)物至營(yíng)養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基中，置30～35℃培養(yǎng)18～24h，分別取上述培養(yǎng)物1mL，加0.9%無(wú)菌氯化鈉溶液9mL，10倍遞增稀釋，取稀釋液1mL，加入到1個(gè)平皿中，每種菌的每1個(gè)稀釋級(jí)平行制備2個(gè)平皿，傾注營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基，置30～35℃培養(yǎng)24～48h，計(jì)數(shù)，選擇每1mL含菌數(shù)為50～100cfu的稀釋級(jí)菌懸液，作為驗(yàn)證試驗(yàn)用菌懸液。接種白色念珠菌的新鮮培養(yǎng)物至改良馬丁培養(yǎng)基中，置23～28℃培養(yǎng)24～48h，取上述培養(yǎng)物1mL，加0.9%無(wú)菌氯化鈉溶液9mL，10倍遞增稀釋，取稀釋液1mL，加入到1個(gè)平皿中，每1個(gè)稀釋級(jí)平行制備2個(gè)平皿，傾注玫瑰紅鈉瓊脂培養(yǎng)基，置23～28℃培養(yǎng)72h，計(jì)數(shù)，選擇每毫升含菌數(shù)為50～100cfu的稀釋級(jí)菌懸液，作為驗(yàn)證試驗(yàn)用菌懸液。
　　2.2供試液的制備
　　
　　從兩瓶樣品中取樣品10g，至滅菌勻漿杯中，加pH7.0無(wú)菌氯化鈉�驳鞍纂司彌_液至100mL，經(jīng)勻漿儀混勻，制成1∶10的供試液。陳香露白露片藥物3個(gè)批號(hào)樣品同法操作。
　　2.3細(xì)菌數(shù)、霉菌及酵母菌數(shù)計(jì)數(shù)方法的驗(yàn)證
　　2.3.1預(yù)試驗(yàn)論文（常規(guī)法）
　　
　　（1）試驗(yàn)組：取1∶10的供試液1mL，加入到1個(gè)平皿中，同法制備8個(gè)平皿，依次加入金黃色葡萄球菌、大腸埃希菌、枯草芽孢桿菌、白色念珠菌的菌懸液1mL（含50～100cfu），每種菌平行制備2個(gè)平皿；取1∶100的供試液1mL，加入到1個(gè)平皿中，同法制備8個(gè)平皿，依次加入金黃色葡萄球菌、大腸埃希菌、枯草芽孢桿菌、白色念珠菌的菌懸液1mL（含50～100cfu），每種菌平行制備2個(gè)平皿；取1∶1000的供試液1mL，加入到1個(gè)平皿中，同法制備8個(gè)平皿，依次加入金黃色葡萄球菌、大腸埃希菌、枯草芽孢桿菌、白色念珠菌的菌懸液1mL（含50～100cfu），每種菌平行制備2個(gè)平皿。含大腸埃希菌、金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌的試驗(yàn)平皿傾注營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基，置30～35℃培養(yǎng)48h，計(jì)數(shù)；白色念珠菌的試驗(yàn)平皿傾注玫瑰紅鈉瓊脂培養(yǎng)基，置23～28℃培養(yǎng)72h，計(jì)數(shù)。
　　
　　（2）菌液組：分別取已制備好的金黃色葡萄球菌、大腸埃希菌、枯草芽孢桿菌、白色念珠菌的菌懸液1mL（含50～100cfu），加入到1個(gè)平皿中，每種菌平行制備2個(gè)平皿。含金黃色葡萄球菌、大腸埃希菌、枯草芽孢桿菌的試驗(yàn)平皿傾注營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基，置30～35℃培養(yǎng)48h，計(jì)數(shù)；白色念珠菌的試驗(yàn)平皿傾注玫瑰紅鈉瓊脂培養(yǎng)基，置23～28℃培養(yǎng)72h，計(jì)數(shù)。
　　
　　（3）供試品對(duì)照組：取1∶10供試液1mL，加入到1個(gè)平皿中，同法制備4個(gè)平皿。取1∶100供試液1mL，加入到1個(gè)平皿中，同法制備4個(gè)平皿。取1∶1000的供試液1mL，加入到1個(gè)平皿中，同法制備4個(gè)平皿。每一稀釋級(jí)中的2個(gè)平皿傾注營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基，置30～35℃培養(yǎng)48h，計(jì)數(shù)；每一稀釋級(jí)中的另2個(gè)平皿傾注玫瑰紅鈉瓊脂培養(yǎng)基，置23～28℃培養(yǎng)72h，計(jì)數(shù)。
　　
　　（4）試驗(yàn)組菌回收率計(jì)算：菌回收率（%）=（試驗(yàn)組平均菌落數(shù)-供試品對(duì)照組平均菌落數(shù)）∕菌液組平均菌落數(shù)。
　　
　　（5）結(jié)果：見(jiàn)表1。大腸埃希菌、白色念珠菌在樣品的1∶10、1∶100、1∶1000供試液中回收率均大于70%；金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌在樣品的1∶1000供試液中回收率均大于70%，在樣品的1∶10、1∶100供試液中回收率均小于70%。根據(jù)上述情況，筆者采用離心沉淀集菌法進(jìn)行再試驗(yàn)。
　　表1陳香露白露片藥物的細(xì)菌數(shù)、霉菌及酵母菌數(shù)常規(guī)方法的驗(yàn)證預(yù)試驗(yàn)結(jié)果（略）
　　2.3.2再試驗(yàn)（離心沉淀集菌法）
　　
　　（1）試驗(yàn)組：從100mL的1∶10供試液中取上清液10mL，3000r/min離心20min，棄去上清液，留底部集菌液約2mL，加pH7.0無(wú)菌氯化鈉�驳鞍纂司彌_液補(bǔ)至10mL，混勻。取其1mL加入到1個(gè)平皿中，同法制備4個(gè)平皿，依次加入金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌的菌懸液1mL（含50～100cfu），每種菌平行制備2個(gè)平皿。另取其1mL，加入到9mLpH7.0無(wú)菌氯化鈉�驳鞍纂司彌_液中，混勻，即為1∶100供試液。取1∶100供試液1mL加入到1個(gè)平
　　皿中，同法制備4個(gè)平皿，依次加入金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌的菌懸液lmL（含50～100cfu），每種菌平行制備2個(gè)平皿。在制備好的平皿中傾注營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基，置30～35℃培養(yǎng)48h，計(jì)數(shù)。
　　
　　（2）菌液組：分別取已制備好的金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌的菌懸液1mL（含50～100cfu），加入到1個(gè)平皿中，每種菌平行制備2個(gè)平皿，傾注營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基，置30～35℃培養(yǎng)48h，計(jì)數(shù)。
　　
　　（3）供試品對(duì)照組：取1∶10供試液1mL，加入到1個(gè)平皿中，同法制備2個(gè)平皿。取1∶100供試液1mL，加入到1個(gè)平皿中，同法制備2個(gè)平皿。同法制備4個(gè)平皿。傾注營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基，置30～35℃培養(yǎng)48h，計(jì)數(shù)。
　　
　　（4）試驗(yàn)組菌回收率計(jì)算：菌回收率（%）=（試驗(yàn)組平均菌落數(shù)﹣供試品對(duì)照組平均菌落數(shù)）∕菌液組平均菌落數(shù)
　　
　　（5）結(jié)果：見(jiàn)表2。采用離心沉淀集菌法后，可去除供試液對(duì)金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌的抑菌作用，使菌回收率大于70%。
　　表2陳香露白露片藥物的金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌離心沉淀集菌法的驗(yàn)證試驗(yàn)結(jié)果（略）
　　2.4控制菌檢查方法的驗(yàn)證
　　2.4.1大腸埃希菌檢查方法的驗(yàn)證
　　
　　（1）試驗(yàn)組：取1∶10供試液10mL和大腸埃希菌的菌懸液1mL（含50～100cfu），加入到膽鹽乳糖增菌液100mL中，置35～37℃培養(yǎng)18～24h，按《中國(guó)藥典》2005年版一部附錄微生物限度檢查法中的大腸埃希菌檢查法進(jìn)行檢查。
　　
　　（2）陰性對(duì)照組：取1∶10供試液10mL和金黃色葡萄球菌的菌懸液1mL（含50～100cfu），加入到膽鹽乳糖增菌液100mL中，置35～37℃培養(yǎng)18～24h，按《中國(guó)藥典》2005年版一部附錄微生物限度檢查法中的大腸埃希菌檢查法進(jìn)行檢查。
　　
　　（3）供試品對(duì)照組：取1∶10供試液10mL，加入到膽鹽乳糖增菌液100mL中，置35～37℃培養(yǎng)18～24h，按《中國(guó)藥典》2005年版一部附錄微生物限度檢查法中的大腸埃希菌檢查法進(jìn)行檢查。
　　
　　（4）結(jié)果：試驗(yàn)組檢出大腸埃希菌，陰性菌對(duì)照組結(jié)果為陰性，供試品對(duì)照組未檢出大腸埃希菌。
　　2.4.2大腸菌群檢查方法的驗(yàn)證
　　
　　（1）試驗(yàn)組：取1∶10、1∶100、1∶1000供試液各1mL和大腸埃希菌的菌懸液1mL（含50～100cfu），加入到3支膽鹽乳糖發(fā)酵培養(yǎng)液中，置35～37℃培養(yǎng)18～24h，按《中國(guó)藥典》2005年版一部附錄微生物限度檢查法中的大腸菌群檢查法進(jìn)行檢查。
　　
　　（2）陰性對(duì)照組：取1∶10、1∶100、1∶1000供試液各1mL和金黃色葡萄球菌的菌懸液1mL（含50～100cfu），加入到3支膽鹽乳糖發(fā)酵培養(yǎng)液中，置35～37℃培養(yǎng)18～24h，按《中國(guó)藥典》2005版一部附錄微生物限度檢查法中的大腸菌群檢查法進(jìn)行檢查。
　　
　　（3）供試品對(duì)照組：取1∶10、1∶100、1∶1000供試液各1mL，加入到3支膽鹽乳糖發(fā)酵培養(yǎng)液中，置35～37℃培養(yǎng)18～24h，按《中國(guó)藥典》2005版一部附錄微生物限度檢查法中的大腸菌群檢查法進(jìn)行檢查。
　　
　　（4）結(jié)果：試驗(yàn)組檢出大腸菌群，陰性菌對(duì)照組結(jié)果為陰性，供試品對(duì)照組未檢出大腸菌群。
　　3討論
　　
　　采用常規(guī)法試驗(yàn)時(shí)，該樣品對(duì)大腸埃希菌、白色念珠菌的加菌回收率均大于70%，證明其對(duì)上述2種供試菌無(wú)抑菌作用。該樣品對(duì)金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌有抑菌作用，在1∶10、1∶100的稀釋級(jí)，其加菌回收率小于70%，低于《中國(guó)藥典》2005年版規(guī)定的回收率不得低于70%才視為無(wú)抑菌作用的要求。結(jié)合該樣品的物理特性和常規(guī)法試驗(yàn)結(jié)果，采用離心沉淀集菌法進(jìn)行試驗(yàn)后，金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌的加菌回收率可大于70%。故陳香露白露片藥物的細(xì)菌數(shù)檢查可采用離心沉淀集菌法，霉菌及酵母菌數(shù)的檢查采用常規(guī)法。
　　
　　由控制菌檢查方法的驗(yàn)證試驗(yàn)結(jié)果表明，采用常規(guī)法試驗(yàn)時(shí)，該樣品對(duì)大腸埃希菌、大腸菌群的檢查無(wú)干擾，故陳香露白露片藥物的控制菌檢查可采用常規(guī)法。
　　
　　因安全原因，黑曲霉［CMCC（F）98003］的驗(yàn)證試驗(yàn)未進(jìn)行。
　　【參考文獻(xiàn)】
　　［1］衛(wèi)生部藥典委員會(huì).衛(wèi)生部藥品標(biāo)準(zhǔn).中藥成方制劑(第八冊(cè))［S］.北京：人民衛(wèi)生出版社，1993:87.