地榆總皂苷（DYS）促造血作用已從體內(nèi)外研究中獲得證實[1]，作者前期的研究發(fā)現(xiàn)[2]，DYS可單獨或協(xié)同細胞因子促進造血細胞增殖，尤其，DYS單獨處理能顯著增加依賴促血小板生成素（TPO）生長的Baf3/Mpl細胞增殖，且在mRNA水平促進TPO受體（TPOR）的表達。

　　[摘要]目的：觀察地榆總皂苷（DYS）對Baf3細胞和32D細胞的促增殖和分化作用，以及對IL-3受體和干細胞因子受體c-kit表達水平的影響。方法：培養(yǎng)依賴IL-3生長的Baf3細胞和32D細胞，在加或不加IL-3條件下，用質(zhì)量濃度為5，10，20，30，40mg・L-1的DYS分別處理細胞24，48，72，96h后，采用CCK8方法檢測細胞增殖；并用Giemsa染色檢測細胞分化；另以RT-PCR方法檢測DYS對Baf3細胞IL-3受體及對32D細胞c-kit表達水平的影響。結(jié)果：DYS單獨處理細胞48h，明顯促進Baf3細胞和32D細胞增殖；與對照細胞比較，DYS處理32D細胞呈現(xiàn)成簇生長并形成許多大的細胞團；在加入IL-3的條件下，DYS也能明顯增強IL-3的促細胞增殖作用。此外，DYS高濃度單獨處理32D細胞可明顯誘導(dǎo)多倍體巨核細胞數(shù)增加，促進巨核細胞分化。在mRNA水平，DYS單獨處理細胞也能明顯上調(diào)IL-3受體和c-kit的表達。結(jié)論：地榆總皂苷單獨作用能促使2種巨核祖細胞的增殖和分化，其作用與上調(diào)IL-3受體和c-kit表達水平有關(guān)。

　　[關(guān)鍵詞]藥學(xué)期刊發(fā)表論文,地榆總皂苷,造血細胞增殖,巨核細胞分化,白細胞介素3,白細胞介素3受體,干細胞因子受體

　　Baf3/Mpl細胞源自于小鼠髓系巨核祖細胞系Baf3，后者依賴IL-3生長。通過轉(zhuǎn)入TPOR后，Baf3細胞也可依賴TPO生長，因此命名為Baf3/Mpl細胞。盡管已證實DYS單獨能促進Baf3/Mpl細胞增殖，且與上調(diào)TPO受體表達水平有關(guān)，但Baf3/Mpl細胞也表達IL-3受體，DYS的促增殖作用與IL-3受體是否也有關(guān)聯(lián)，尚值得進一步探索。本研究采用未經(jīng)Mpl受體轉(zhuǎn)染的Baf3親本細胞在加入或缺乏IL-3的體外培養(yǎng)條件下，觀察地榆總皂苷對細胞生長的影響，同時研究了地榆總皂苷對IL-3受體表達的影響；另選擇了依賴IL-3生長的32D小鼠髓系祖細胞系，研究了地榆總皂苷的促增殖作用，并觀察了DYS誘導(dǎo)巨核細胞分化的作用以及對干細胞因子受體c-kit表達的影響，為進一步探索促造血的多效性奠定基礎(chǔ)。

　　1材料

　　1.1地榆總皂苷制備取干燥地榆（購自成都市五塊石藥材市場，并由成都中醫(yī)藥大學(xué)賈敏如教授鑒定為地榆SanguisorbaofficinalisL.）粉碎成粗粉，稱取500g并加入10倍量95%乙醇浸泡30min，回流提取3次，每次60min，尼龍布過濾；合并提取液，減壓過濾得透明微紅色液體，減壓回收乙醇，加水混懸，保溫至60℃，乙酸乙酯趁熱萃取，連續(xù)3次，合并乙酸乙酯萃取液，回收乙酸乙酯，即得地榆總皂苷粗提物。HPLC測定地榆皂苷I質(zhì)量分數(shù)大于70%。使用前用DMSO溶解，無菌PBS稀釋至1g・L-1，待用。

　　1.2試劑與儀器RPMI1640培養(yǎng)基（Gibco）；新生胎牛血清（HyClone）；重組小鼠白介素3（mIL-3，Sigma公司）；一步法RT-PCR試劑盒（Takara）；二氧化碳培養(yǎng)箱（Sanyo公司）；普通光學(xué)顯微鏡和倒置相差顯微鏡（Olympus公司）；多功能酶標(biāo)儀（PerkinElmer公司）。

　　2方法

　　2.1細胞及細胞培養(yǎng)依賴IL-3生長的Baf3細胞和32D細胞系均購買自ATCC。細胞采用含10%胎牛血清的RPMI1640培養(yǎng)基培養(yǎng)，IL-3（2μg・L-1）參照說明補充加入培養(yǎng)體系中。

　　2.2細胞增殖測定Baf3和32D細胞維持培養(yǎng)在對數(shù)生長期，用無血清培養(yǎng)基洗滌3次，懸浮于含0.5%胎牛血清的無細胞因子培養(yǎng)基中，次日以適量細胞數(shù)分別接種于96孔培養(yǎng)板內(nèi)，分別設(shè)置空白對照組、地榆總皂苷單獨處理組、IL-3單獨處理組、地榆總皂苷+IL-3處理組。用無IL-3、無血清培養(yǎng)基稀釋地榆總皂苷溶液，按照設(shè)置濃度加入細胞，使其終質(zhì)量濃度分別為5，10，20，30，40mg・L-1，IL-3濃度參照細胞維持生長所需濃度加入。細胞在37℃條件下連續(xù)培養(yǎng)至指定時間，采用CCK8試劑盒并參照說明書提供的方法進行細胞增殖檢測。

　　2.3Giemsa染色和巨核細胞計數(shù)Baf3和32D細胞分別接種于6孔板中，采用較高質(zhì)量濃度（40mg・L-1）的DYS分別處理2種細胞，Baf3細胞在DYS處理120h后涂片用甲醇固定5min，Giemsa染色10min，染色后的標(biāo)本用緩沖液洗滌，晾干，顯微鏡觀察其形態(tài)學(xué)變化；32D細胞在DYS處理9d后光學(xué)顯微鏡下以細胞核內(nèi)分裂分類計數(shù)100個細胞中的多倍體巨核細胞數(shù)，分類以雙核為4N，4核為8N，依此類推。

　　2.4RT-PCR檢測Baf3細胞和32D細胞分別接種在6孔培養(yǎng)板，加入地榆總皂苷溶液（10mg・L-1），37℃條件下繼續(xù)培養(yǎng)，分別于24，48，72h收獲細胞，用Trizol試劑提取總RNA。參照RT-PCR試劑盒擴增細胞內(nèi)目的基因，各基因引物均由作者設(shè)計，上海基康生物技術(shù)有限公司合成，引物序列及產(chǎn)物片段大小見表1。IL-3R與c-kit擴增條件均為逆轉(zhuǎn)錄（RT）：50℃30min；94℃2min；PCR擴增條件：94℃15s，48℃15s，72℃45s，24～26個循環(huán)；最后延伸72℃10min，4℃1h。同時設(shè)置內(nèi)參基因GAPDH的擴增，循環(huán)數(shù)為24，其余同目的基因擴增。擴增產(chǎn)物進行1.5%瓊脂糖凝膠電泳，紫外燈下觀察并拍照，同時采用半定量方法（目的基因/GAPDH）計算目的基因表達水平。2.5統(tǒng)計學(xué)方法數(shù)據(jù)分析采用SPSS17.0統(tǒng)計軟件包處理，實驗數(shù)據(jù)均以±s表示，組間均數(shù)比較采用單因素方差分析。

　　3結(jié)果

　　3.1DYS對Baf3細胞增殖的影響B(tài)af3細胞在缺乏IL-3培養(yǎng)條件時，細胞增殖明顯受抑制，但在含IL-3的培養(yǎng)條件下，Baf3細胞增殖明顯，證實Baf3細胞依賴IL-3生長；在不含IL-3的培養(yǎng)條件下加入DYS（10mg・L-1）后，Baf3細胞數(shù)量也明顯增加，并呈時間依賴；在含IL-3的培養(yǎng)條件下加入DYS（10mg・L-1），Baf3細胞數(shù)量增加更為明顯，并優(yōu)于IL-3單獨刺激的細胞增殖結(jié)果。為了證實DYS的濃度依賴關(guān)系，進一步的研究結(jié)果顯示：在不加IL-3的條件下，DYS促進細胞增殖的作用僅在20mg・L-1范圍內(nèi)，超過此濃度范圍，細胞增殖減弱并呈現(xiàn)抑制細胞增殖的作用，但觀察到細胞胞體變大的現(xiàn)象，見圖1。

　　3.2DYS對32D細胞增殖的影響另采用依賴IL-3生長的32D細胞，證實了DYS促細胞增殖的作用。32D細胞在缺乏IL-3培養(yǎng)條件時，細胞增殖明顯受抑制，但在含IL-3的培養(yǎng)條件下，32D細胞增殖明顯，證實32D細胞依賴IL-3生長；在不含IL-3的培養(yǎng)條件下加入DYS（10mg・L-1）后，32D細胞數(shù)量明顯增加，并呈時間依賴，此結(jié)果與在Baf3細胞中觀察到的結(jié)果一致，見圖2。

　　32D細胞依賴IL-3生長，加入IL-3后，細胞快速增殖并聚集成簇，形成明顯的細胞團，該成簇生長的特征反映了32D細胞增殖的最佳狀態(tài)。通過32D細胞加入IL-3后成簇生長的特征，評價了DYS單獨促32D細胞增殖的能力。對照細胞在缺乏IL-3或DYS的條件下，細胞逐漸死亡，在培養(yǎng)第9天，僅有單個散在的活細胞存在，且數(shù)量非常有限；而加入DYS的細胞明顯聚集成簇，與IL-3加入后形成的細胞團相同，但聚集成簇的細胞團略小于加入IL-3的細胞，此結(jié)果進一步證實了DYS的促造血生長作用，見圖3。

　　3.3DYS對32D細胞分化的影響為了證實DYS誘導(dǎo)巨核細胞分化的作用，在缺乏IL-3的培養(yǎng)條件下，采用20mg・L-1的DYS單獨處理細胞，在第4天和第9天經(jīng)Giemsa染色，見圖4，結(jié)果顯示：與培養(yǎng)第4天的對照細胞相比，DYS單獨處理細胞后第4天，多倍體巨核細胞數(shù)量增加，且胞體變大；培養(yǎng)至第9天細胞大部分死亡，僅剩胞體變大的細胞。經(jīng)Giemsa染色并記錄不同倍體巨核細胞的百分率，結(jié)果顯示：在缺乏IL-3的條件下培養(yǎng)9d，2N細胞幾乎全部死亡，4～32N巨核細胞數(shù)明顯增加，DYS處理細胞中的4N細胞明顯減少，但8～32N細胞明顯增加，其中16N細胞增加尤其明顯，為對照細胞的2.3倍。此結(jié)果初步證實地榆具有促進巨核祖細胞成熟分化的作用，見圖5。

　　3.4DYS對Baf3細胞mIL-3受體表達水平的影響B(tài)af3細胞表達mIL-3受體并依賴IL-3生長，DYS是否能上調(diào)mIL-3受體的表達，值得進一步研究。采用RT-PCR技術(shù)，研究了地榆總皂苷對IL-3受體mRNA表達水平的影響，結(jié)果顯示，DYS單獨處理Baf3細胞48h后，IL-3受體mRNA水平明顯增加，但72h后下降至對照水平，見圖6。

　　3.5DYS對32D細胞c-kit表達水平的影響c-kit為干細胞因子受體，在巨核祖細胞向成熟分化過程中發(fā)揮了重要作用。因此，進一步檢測了DYS對32D細胞的c-kit表達的影響。與對照細胞比較，DYS單獨處理細胞后能明顯上調(diào)c-kit的表達，此結(jié)果提示地榆總皂苷也能通過上調(diào)巨核祖細胞c-kit表達而發(fā)揮促巨核細胞增殖和分化的作用，見圖6。

　　4討論

　　前期研究發(fā)現(xiàn)地榆總皂苷能單獨或增強TPO刺激的Baf3/Mpl細胞增殖，且能顯著增加TPO受體表達水平。Baf3/Mpl細胞源自于Baf3細胞，前者通過轉(zhuǎn)入TPO受體Mpl后依賴TPO因子生長。本研究中，采用了無外源性Mpl表達并依賴IL-3生長的Baf3細胞以及依賴IL-3生長的32D細胞，評價了地榆總皂苷的促造血增殖作用。在缺乏IL-3的條件下，地榆總皂苷能明顯促進Baf3細胞和32D細胞增殖，表明DYS可不依賴TPO和IL-3而促進巨核祖細胞的增殖。此外，延長DYS處理32D細胞的時間，可明顯增加16～32N巨核細胞數(shù)量，證實DYS單獨處理細胞不僅可促其增殖，而且具有促其向巨核細胞成熟分化的作用。

　　早期認為，巨核細胞增殖以及分化成熟主要受巨核細胞祖細胞集落刺激因子（MK-CSF）和促血小板生成素（TPO）的雙水平調(diào)節(jié)。隨后對小鼠和人類巨核細胞的體外研究表明，巨核細胞生成受多種體液因子的多水平調(diào)節(jié)，包括IL-3，IL-6和EPO細胞因子。近來研究證實，在造血干細胞和祖細胞中，干細胞因子（SCF）及其受體c-kit對巨核細胞增殖、分化和產(chǎn)生血小板的影響較其他細胞更為顯著[3-4]。DYS促進巨核祖細胞增殖以及分化的作用可能與其他受體如IL-3受體和c-kit有關(guān)。據(jù)此，進一步在mRNA水平研究了DYS對2種受體表達的影響，結(jié)果發(fā)現(xiàn)DYS確能上調(diào)2種受體的表達。

　　IL-3受體屬于Ⅰ型造血細胞因子受體超家族[5]，由特異性α鏈和β鏈構(gòu)成，其α鏈與IL-3結(jié)合形成低親和受體異二聚體，隨后與β鏈結(jié)合形成高親和受體復(fù)合物，導(dǎo)致β鏈的磷酸化并激活相應(yīng)的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑[6-8]。IL-3受體主要在骨髓細胞中表達，與IL-3結(jié)合后可促進多種造血細胞增殖，包括中性粒細胞、嗜酸性粒細胞、嗜堿性粒細胞、單核細胞、巨核細胞、紅細胞以及B細胞[9]。本研究發(fā)現(xiàn)DYS在無外源性IL-3的作用下可促進需依賴IL-3生長的2種巨核細胞增殖，同時上調(diào)細胞IL-3R的表達，這提示DYS可能具有擬IL-3的作用，包括促進巨核細胞等多種造血細胞的增殖及成熟。另有研究表明，IL-3不僅可直接作用于造血細胞，還可通過協(xié)同干細胞因子（SCF）及其受體c-kit，經(jīng)一系列反應(yīng)激活下游信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，從而調(diào)節(jié)骨髓巨核細胞的增殖與分化。且多篇文獻報道，激活SCF-c-kit通路在抗腫瘤藥物損傷后的造血恢復(fù)過程中可表現(xiàn)出良好的血小板恢復(fù)作用[3-4]。由此推測DYS對IL-3R和c-kit表達水平的上調(diào)是其發(fā)揮促巨核祖細胞增殖和分化的重要機制之一。同時，結(jié)合前期研究結(jié)果，DYS可不依賴TPO或IL-3而促進Baf3/Mpl，Baf3，32D細胞生長，表明DYS具有明顯的多效細胞因子作用。由于本研究中DYS為地榆總皂苷提取物，DYS中除含有地榆皂苷I單體成分外，尚含有多種其他成分，進一步區(qū)分DYS中皂苷及非皂苷類成分的作用，尤其研究不同單體成分對巨核祖細胞增殖及分化的作用將具有更為重要的價值和意義。

　　[參考文獻]

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