苦木為我國(guó)南方地區(qū)常用中藥，為苦木科苦樹屬植物Picrasmaquassioides（D.Don）Benn.的干燥枝和葉，性寒，味苦，有清熱解毒，祛濕的功效，用于風(fēng)熱感冒，咽喉腫痛，濕熱瀉痢，濕疹，瘡癤，蛇蟲咬傷[1]�；瘜W(xué)成分研究表明，苦木中主要含有生物堿類，內(nèi)酯類，黃酮類等化學(xué)成分[2-6]，其中生物堿類成分主要為鐵屎米-6-酮型及β-咔巴啉型。

　　[摘要]建立RP-HPLC同時(shí)測(cè)定苦木中4個(gè)生物堿與1個(gè)黃酮成分含量的方法，并進(jìn)行多批次藥材成分分析，為苦木質(zhì)量評(píng)價(jià)提供依據(jù)。采用KromasilC18色譜柱（4.6mm×250mm，5μm），流動(dòng)相為乙腈-0.1%磷酸，梯度洗脫，流速1.0mL・min-1，檢測(cè)波長(zhǎng)254nm。4個(gè)生物堿苦木堿L，苦木堿B，苦木堿F，苦木堿D和黃酮高麗槐素的標(biāo)準(zhǔn)曲線及線性范圍依次為Y=6525.6X+37.25（0.009～1.780μg，r=0.9968），Y=3662.3X+41.55（0.005～0.920μg，r=0.9995），Y=3763.1X+146.87（0.015～3.060μg，r=0.9990），Y=2174.1X+21.52（0.003～0.620μg，r=0.9995），Y=276.25X+7.65（0.010～1.960μg，r=0.9989），平均加樣回收率在98.02%～101.8%，RSD%在1.2%～2.8%，重復(fù)性及精密度良好。經(jīng)過系統(tǒng)的方法學(xué)考察，該法簡(jiǎn)便，準(zhǔn)確，可用于苦木藥材的質(zhì)量分析及控制。

　　[關(guān)鍵詞]醫(yī)學(xué)論文發(fā)表,苦木,β-咔巴啉類生物堿,鐵屎米-6-酮類生物堿,二氫異黃酮,RP-HPLC

　　《中國(guó)藥典》2010年版（一部）收載苦木的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)為性狀鑒別，顯微鑒別及生物堿薄層色譜鑒別，無含量測(cè)定項(xiàng)�？嗄炯昂�苦木制劑的質(zhì)量分析報(bào)道多為HPLC測(cè)定其中鐵屎米酮型生物堿的含量[7-10]，而對(duì)β-咔巴啉型生物堿及黃酮類成分的質(zhì)量控制尚鮮見報(bào)道。為有效控制苦木質(zhì)量提供可靠的方法，本研究建立RP-HPLC同時(shí)測(cè)定苦木中2類生物堿（β-咔巴啉型生物堿，包括苦木堿L，苦木堿B；鐵屎米-6-酮型生物堿，包括苦木堿F，苦木堿D）及黃酮類（高麗槐素）含量，并進(jìn)行多批次樣品中上述成分含量測(cè)定，以期為苦木藥材及其制劑的質(zhì)量控制標(biāo)準(zhǔn)的再提高提供可資借鑒的基礎(chǔ)研究資料。

　　1材料

　　大連依利特P230高效液相色譜儀，配置紫外檢測(cè)器及EC2000色譜工作站（大連伊利特分析儀器有限公司）；AT-330色譜柱恒溫箱（天津奧特賽恩斯儀器有限公司）；Sartorius電子天平（北京賽多利斯儀器系統(tǒng)有限公司）。液相用乙腈為色譜純（美國(guó)Honeywell），水為超純水，其他試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純（汕頭市光華化學(xué)廠有限公司）。

　　苦木堿L（1-hydroxymethyl-β-carboline，1），苦木堿B（1-methoxicabony-β-carboline，2），苦木堿F（4-methoxy-5-hydroxy-canthin-6-one，3），苦木堿D（4，5-dimethoxy-canthin-6-one，4），高麗槐素（maackiain，5）均為自制，經(jīng)光譜學(xué)鑒定結(jié)構(gòu)，色譜法檢測(cè)其純度均為98%以上。

　　苦木測(cè)試樣品共10批，經(jīng)廣州中醫(yī)藥大學(xué)藥用植物學(xué)教研室潘超美教授鑒定為苦木科苦樹屬植物苦木P.quassioides的干燥枝和葉，憑證標(biāo)本現(xiàn)保存于廣州中醫(yī)藥大學(xué)臨床藥理研究所。

　　2方法與結(jié)果

　　2.1色譜條件及系統(tǒng)適應(yīng)性KromasilC18色譜柱（4.6mm×250mm，5μm）；流動(dòng)相為乙腈（A）-0.1%磷酸（B），梯度洗脫（0～22min，18%～25%A；22～30min，25%～40%A；30～60min，40%～45%A）；流速1.0mL・min-1；檢測(cè)波長(zhǎng)254nm。對(duì)照品和樣品進(jìn)樣量均為15μL，色譜圖見圖1。理論塔板數(shù)苦木堿L和B不低于8000，苦木堿F和苦木堿D不低于1萬，高麗槐素不低于5000。

　　2.2對(duì)照品溶液的制備精密稱取對(duì)照品1～5各適量，用甲醇充分溶解并定容，即得混合對(duì)照品儲(chǔ)備液，其中1～5的質(zhì)量濃度分別為88.8，46.0，145.2，31.2，98.0mg・L-1。

　　2.3苦木供試品溶液的制備取干燥至恒重的苦木粉末約1.0g，精密稱定，加95%乙醇50mL，超聲提取2次，每次15min，提取液過濾，濾液減壓回收溶劑，殘?jiān)�用甲醇溶解并定容�?5mL，搖勻，進(jìn)樣前過0.45μm微孔濾膜。

　　2.4線性關(guān)系考察分別精密吸取混合對(duì)照品溶液0.1，1，5，10，15，20μL，進(jìn)樣測(cè)定，以峰面積積分值（Y）對(duì)進(jìn)樣質(zhì)量（X）進(jìn)行線性回歸，得回歸方程，結(jié)果見表1。

　　2.5精密度試驗(yàn)精密吸取混合對(duì)照品溶液連續(xù)進(jìn)樣5次，5個(gè)目標(biāo)成分的峰面積RSD（n=5）在0.7%～1.2%，表明儀器精密度良好。

　　2.6穩(wěn)定性試驗(yàn)精密吸取苦木供試品溶液，分別于0，2，4，8，18，24h依次進(jìn)樣，5個(gè)成分峰面積的RSD（n=8）在1.8%～2.8%，表明供試品在24h內(nèi)穩(wěn)定。

　　2.7重復(fù)性試驗(yàn)取同一批次樣品6份，制備供試品溶液，測(cè)定5個(gè)化合物的含量，RSD（n=6）在1.6%～2.3%，表明該方法重復(fù)性良好。

　　2.8加樣回收率稱取已知含量的同一批樣品分別加入5個(gè)對(duì)照品適量，制備供試品溶液，進(jìn)樣測(cè)定，見表2。

　　2.9樣品測(cè)定取10批次苦木樣品，制備供試品溶液，進(jìn)樣測(cè)定，每批樣品平行制備3份，每份進(jìn)樣3次，見表3。3討論

　　3.1色譜條件優(yōu)選比較了甲醇-水，乙腈-水，乙腈-0.1%冰醋酸，乙腈-0.1%三氯乙酸，乙腈-0.1%磷酸等溶劑系統(tǒng)，以乙腈-0.1%磷酸溶液進(jìn)行梯度洗脫時(shí)，各待測(cè)成分的分離度好。

　　3.2供試品溶液制備方法的優(yōu)選以從苦木中分離得到的4個(gè)生物堿及1個(gè)黃酮成分含量為指標(biāo)，比較了不同提取方法（超聲波萃取，熱回流，索式提取法），不同提取溶媒種類（95%，80%，70%，50%乙醇），不同提取溶媒用量（10，20，30，50，60，80倍量），提取時(shí)間（15，30，40，60min），提取次數(shù)（1，2，3次），確定了2.3所述供試品制備方法。

　　3.3苦木藥材的質(zhì)量評(píng)價(jià)迄今為止，苦木藥材質(zhì)量評(píng)價(jià)尚缺乏有效的方法，2010年版《中國(guó)藥典》苦木質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)無專屬成分含量測(cè)定及限度，有學(xué)者采用HPLC測(cè)定苦木中鐵屎米-6-酮型生物堿的含量，但未見β-咔巴啉型及其他成分含量測(cè)定的報(bào)道。本文采用RP-HPLC同時(shí)測(cè)定10批苦木樣品中4個(gè)生物堿及1個(gè)二氫異黃酮的含量，結(jié)果5個(gè)指標(biāo)成分的含量范圍分別為0.20～0.34mg・g-1（1），0.26～0.45mg・g-1（2），3.31～3.86mg・g-1（3），0.18～0.52mg・g-1（4）和2.64～3.98mg・g-1（5）。其中2個(gè)β-咔巴啉型生物堿的總量平均值為0.61mg・g-1，2個(gè)鐵屎米-6-酮型生物堿的總量平均值為3.98mg・g-1。不同產(chǎn)地及采收時(shí)間的樣品含量差異較小，初步推斷該藥材質(zhì)量較穩(wěn)定，尚需大樣本樣品驗(yàn)證。

　　根據(jù)本實(shí)驗(yàn)樣品測(cè)定結(jié)果建議苦木藥材的質(zhì)量控制標(biāo)準(zhǔn)中增加鐵屎米-6-酮型生物堿即苦木堿F的含量測(cè)定并制定其含量限度；增加β-咔巴啉型生物堿及二氫異黃酮即高麗槐素的鑒別項(xiàng)。

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　　Simultaneousdeterminationof4alkaloidsandaflavonoidin